详细分析杜恩斯匀浆器的操作步骤流程
更新时间：2019-11-20 点击次数：1747次
杜恩斯匀浆器的电源是两个AA干电池，可直接用在离心管里匀浆，配上不同的槌和管便可实现从0.5ml至50ml的组织匀浆；匀浆快速，便用轻便，操作简单，无需特别维护。提供无菌包装，无DNA酶和RNA酶，无致热源的一次性使用槌；也有可反复使用的聚丙烯（PP）材料槌和不锈钢（SS）槌。
1、获得目的基因：
a、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物，PCR循环获得所需基因片段。
b、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第1链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
2、构建重组表达载体：
a、杜恩斯匀浆器载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
b、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
3、获得含重组表达质粒的表达菌种：
a、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
b、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
c、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
4、诱导表达：
a、杜恩斯匀浆器挑取含重组质粒的菌体单斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
b、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中,37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（*0.6，大约需3hr）。
c、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
d、分别取菌体1ml,离心12000g×30s收获沉淀，用100μl1%SDS重悬，混匀,70℃10min。
e、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
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